新医学时代治疗性基因组编辑(2) - 世界最新医学信息文摘杂志社投稿

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新医学时代治疗性基因组编辑(2)

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工程化核酸酶平台有六种，四种是基本的、两种是杂交的，它们是：工程化巨核核酸酶、ZFNs、TALENs、CRISPR/ Cas9核酸酶、巨大TAL核酸酶和Cas9-FokI核酸酶（表1）。这些核酸酶平台之间都有细微的差异，例如，构建起来的折断类型是不同的：大范围核酸酶和巨大TALs生成的是3′突出端的折断；ZFNs构建的是5′突出端的折断；TALENs构建的折断在位置上是可变的，通常是（但不总是）5′突出端，由FokI核酸酶（Fn）的性能决定；而CRISPR/Cas9核酸酶构建的是钝的折断。但总的来说，这些平台中每一个都可以介导它们的编辑效用，是通过一种DSB的构建实现的，因此它们共享了一种基础性的作用机制。

表1.四种标准的核酸酶平台的比较特征核酸酶　　靶位点长度　　识别机制　　第一次用于人体细胞设计的难易程度　　元件数量mRNA转录本的大小工程化巨核核酸酶＞18bp 蛋白质-DNA 1994年（I-SceI）极端困难短锌指核酸酶　18-36bp　蛋白质-DNA　2003年　　短TAL效应物巨核核酸酶24-40bp 2013年　　简单　1或2　　长蛋白质-DNA 2011年容易困难　2 1 2长CRISPR/ Cas9核酸酶19-22bp（化脓链球菌Cas9）华生－克里克式碱基配对RNA-DNA

NHEJ介导的基因组编辑所需要的唯一工具是一种工程化核酸酶，但是HR介导的基因组编辑还需要一种工程化的供体性载体。供体性载体可以被设计来使单个碱基对变化发生模板化扩增或者将大型多基因盒插入到基因组内。核酸酶介导的基因组编辑的同源臂可以比鼠胚胎干细胞内HR介导的基因打靶所要求的同源臂短许多：不再必须有10千碱基对或更长，它们可以短至400碱基对。但是，如果将同源臂进一步缩短至400碱基对以下，或将减少总体编辑效率。单链寡核苷酸（ssODNs）还曾经被用来催动导入一种折断后使微小核苷酸改变发生模板化扩增。单链寡核苷酸可以很容易得到合成，这种方法易于为研究人员得到和使用，但是，单链寡核苷酸构建基因组内一种靶击性改变的机制并不依赖于经典的同源重组途径，这种事情还没有得到充分的认识。单链寡核苷酸甚至还可以诱导癌细胞内的复制和细胞周期停滞，并且很可能比原初治疗学相关人体细胞类型更为值得怀疑，这部分地得到了胡班（Hoban）等人的证明。

输送和处理的研发问题

这个领域内的魔咒一直是基因治疗的三个最重要问题：输送，输送，还是输送。基因组编辑的工具箱已经扩展开来，这一魔咒现在还被用于治疗性基因组编辑的许多问题中：什么是将高活跃性基因组编辑试剂输送进入临床相关性细胞类型的最理想程序呢？这个问题的回答正在日益形成疾病特异性。确定恰当的输送战略，最重要的注意事项是：基因组编辑相对于基因增益战略来说是一种切中肯綮的方法。事实上，核酸酶的持续表达不仅是不需要的，还应该规避：某种核酸酶的连续表达增加了有害基因组不稳定性的机率，既可能使受编辑细胞的适应能力减弱，又可以造成已暴露细胞的转化。

对于细胞的体外到体内操作来说，标准的非病毒性输送方法，如核酸酶之于RNA或者核糖核蛋白（RNP）之于CRISPR/Cas9系统，似乎是最有希望的方法。输送核酸酶元件如RNA或RNP，保证了既激活I型干扰素应答，又使表达的持续期最小化。RNA或RNP可以通过一系列机制输送进入一个细胞内，这些机制是由特定细胞类型用不同的复合体转染的能力所决定的。有效穿越所有细胞类型的输送的一种通用方法是电穿孔：使用RNA或RNP将这类细胞混合起来，然后一类简短的电脉冲穿越这些混合物，从而构建起了一些膜孔，让RNP或RNA进入膜内。目前，已经有多种不同的电穿孔仪器可供使用，通过这些仪器，可以发现构建最小细胞毒性的电穿孔情形，条件是激活天然免疫系统的DNA或其他核苷酸不被掺合进入混合物中。对于需要核酸酶的简单应用来说，这似乎是一种稳健的解决方案。对于需要同源重组介导的编辑的用途来说，还需要一种DNA分子得到输送。将裸露DNA输送进入癌症细胞株，已经是一种输送供体载体的有效方法，但是将裸露DNA输送进入原初细胞，尤其是T细胞和造血干/祖细胞，会激活一种有害的天然免疫应答，既降低基因组编辑的频率，又危及被编辑细胞的优度。使用腺相关病毒（AAV）将供体模板输送进入细胞，可以是问题的一种解决方案，因为AAV与许多病毒一样，已经进化到了可以逃避被天然细胞内免疫应答识别的程度。

对于要求细胞在体编辑的治疗性应用来说，挑战更为巨大，还没有确定哪怕是一种解决方案。再者说，在体输送问题的解决方案可能各自不同，取决于需要被鉴定的靶细胞类型。例如，编辑肝细胞的解决方案很可能与编辑肌肉的解决方案有非常大的不同，还可能与编辑中枢神经系统内细胞的解决方案大相径庭。尽管如此，随着具有优先转导不同的在体细胞类型的多种不同AAV病毒血清型的研发，输送mRNAs进入细胞的新方法的研发以及输送特异性组织的纳米颗粒（包括脂质基和非脂质基纳米颗粒）的复杂性日益增加，似乎可以在不久的将来形成一些解决方案。研发一种核酸酶在持续期间内不表达的输送方法是重要的，既可以从基因毒性立足点出发，也可以从免疫学立足点出发。这是可以预期的，但必须得到证明，否则，所有的工程化核酸酶平台将被免疫系统察觉为外源，并将引发一种稳健的免疫应答，这种免疫应答能够消除治疗性编辑细胞并可导致中毒性器官损伤。