新医学时代治疗性基因组编辑(5) - 世界最新医学信息文摘杂志社投稿

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新医学时代治疗性基因组编辑(5)

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摘要：

评估某种核酸酶的特异性既有偏倚性方法也有非偏倚性方法。生物信息学工具的基本原理是搜索与靶位点相似序列的位点，这有助于预测哪些脱靶位点应该得到检查。一旦一套位点得到了鉴定，就可以应用深度测序来审查那些位点，以便确定在那些位点上是否存在核酸酶产生的插入/缺失。基于深度测序方法学目前的错误率，某种给定位点的检测限度是0.01%左右。而且，生物信息学算法仍然处于它们的早期研发阶段，还不能可靠地鉴定所有潜在的脱靶位点。为了使用生物信息学来对偏倚性方法进行补充，人们新研发了非偏倚性工具，包括折断指导性测序、HTGTS、BLESS和Digenome-seq方法。其他试验使用染色体外DNA，包括腺相关病毒、裸露DNA质粒和整合缺陷性轮状病毒载体来捕捉折断，有助于评估某种核酸酶的特异性。这些工具拥有特定的效力，因为它们还可以鉴定规模性染色体重排（如易位），后者使用偏倚性方法是不能得到鉴定的。由于染色体易位将是一种罕见但是不可避免的诱导性双链折断的结果，它的严谨操作可以避免靶向那些在治疗性基因组编辑研发阶段癌症关联性染色体易位所涉及的基因。

这些无偏倚方法的挑战是，它们已经在特异性癌症细胞株内得到了研发，这些细胞株并没有完整的DNA修复通路，它们需要适应于拥有完整DNA修复通路的原初临床相关性细胞类型。而且，这些工具还提供了对优化某种核酸酶的特异性有用的信息。例如，如果这些试验揭示了核酸酶拥有多个脱靶位点，则它们提示核酸酶应该得到再设计，以更加具有特异性。对于锌指核酸酶来说，这可能需要使用核酸酶结构域中强迫性异二聚体结构，或者探索氨基酸内的特异性改变，来调整对靶序列的识别。对于TAL效应物核酸酶来说，这可能需要使用核酸酶结构域中强迫性异二聚体结构，或者使用TAL效应物识别结构域内的替代性重复可变性双残基（RVDs）。对于CRISPR/Cas9核酸酶来说，改善设计可能需要检验某种不同的指导序列，或者使用某种截断顶端的指导序列或配对切割酶方法。对于所有这些平台来说，可以通过限制核酸酶表达期间来增加特异性，这种期间是减少核酸酶暴露的AUC值（曲线下面积）的药理学等价物。

对于直接鉴定核酸酶的潜在脱靶位点的意图来说，一种补充方法是通过更为经典的功能性药理学－毒理学方法来评估基因组编辑过程。这种战略评估的是，基因组编辑过程是否会构建出不能执行它们正常功能（例如造血干细胞重构多谱系血细胞生成的能力）并转化成为癌细胞的细胞，或者是否会导致群体变得克隆斜交（一种可能的预兆，细胞的构建可能在某种时间框架后得到转化，不仅仅可以用目前的试验来测度）。

偏倚性、非偏倚性和功能性方法需要在受研的治疗性细胞类型内得到执行，使用的是规划好的临床级别基因组编辑过程，因为在其他细胞类型内的评估，尤其是已经转化了的癌症细胞株的评估，可能是不相关的。

应该记住的一个重要原理是分裂中的细胞正在形成持续性的基因组学挑战（激发）。据估计，每次当细胞分裂的时候，它必须修复 20~40个DNA双链折断，不用考虑数百万个其他类型的DNA病灶。这种天然基因组学挑战的结果是一个正常分裂干细胞在每次细胞分裂中获得了接近3~30个突变。据估计在每个个体内每秒发生了一百万个突变。有人已经提出，通过病人衍生的诱导多潜能细胞的基因组编辑而进行的基因纠正，然后进行全基因组测序来确定是否已经发生了有害突变，可能是一种更为安全的方法。从体外到体内扩展所导致的突变负荷，从单个细胞到治疗相关性细胞数目（对于造血系统疾病来说，根据病人细胞大小的不同，介于50~800百万个细胞的数量级），相对于只修饰巨大数量的体细胞而不能对任何一个细胞的基因组进行测序，可能更具致癌性。

胚系基因组编辑的挑战

强劲的基因组编辑工具箱的研发，并用来通过受精卵注射构建多种多样的遗传修饰物种，已经提高了这样的可能性：一些人可能使用人体受精卵内的基因组编辑来构建人体。这种可能性得到了一些中国研究人员工作的彰显，他们在三原核人体受精卵内使用了这种方法，这类人体受精卵从遗传学上来说不能在人体内得到研发，但是在概念上接近于与二倍体受精卵相一致。三原核受精卵注射实验提示了这种过程的低效率和不可预测性，这些发现得到了使用健康二倍体受精卵的动物实验的预测。这些结果清楚地证明，如同受精卵注射之类的基因组编辑技术应用，尽管从伦理学判决上来说是可允许的或令人满意的，还不足以进入人体应用。而且，这些特异性实验和总体概念已经产生了大量的专业或非专业的文献报道。在发展方向上来说仍有许多问题需要加以确定，但是就前沿研究工作来说，我希望提出自己的几项原则：首先，伦理学问题不应该阻碍基因组编辑工具在研究中的运用，这种运用为胚系细胞、胚系细胞研发和早期胚胎发育提供了更好的认识。其次，应该听取来自不同领域的科学领军人物的讨论，还要考虑来自不同的利益相关者的意见，尤其包括那些发生了多个世代的致命性遗传病家系的意见。第三，目前还没有单个的伦理学观点形成优势观点，理想的结果是，新的认识和观点可以整合进入一种持续、反复的过程，而不仅仅是形成一种在单个时间点上的清晰分辨率。最后，使用基因组编辑的问题可能导致特异性基因型传播到未来世代，需要放在这些动态的背景下加以考虑，它们已经发生，同样也影响到了未来世代的基因型结构。两项这样的例子是选择性受精卵植入中的植入前遗传学诊断和治愈或帮助遗传疾病病人（一种明确的好事），使得他们不将他们的致病突变遗传给他们的儿孙们。